nih3t3细胞 nih3t3细胞用什么培养基

简述细胞中原癌基因转变成癌基因的主要途径有哪些

聚合成胶。已铺好Matri。在作不同浓度TNFα下的HCCC29810gel的t将48.5mlranswell

求做western blot时提取贴壁细胞总蛋白详细的protocol

4.

以6孔板的一个孔为例，先把培养液吸出，加入200ul的细胞裂解液，摇床摇15分钟，加loading buffer冰上放置5分钟，用细胞刮把皿底刮几次，然后全部吸出放到离心管里，95°水浴或者金属浴煮10分钟。

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nih3t3细胞 nih3t3细胞用什么培养基

培养板准备

每个人的方法都不太一样吧，有的会在收样之后离心去沉淀，有的会再超声几分钟，有的直接拿loading buffer当裂解液用，个人觉得这些别都不会影响你实验结果。

不过煮肯定是必须的，不然没法保存

一步法动物细胞活性蛋白提取试剂盒

产品编号：BSP022

产品：

动物细胞活性蛋白提取试剂盒可以高效，快速地从培养的悬浮或贴壁的动物细胞中提取有活性的细胞质和白质，该试剂采用一种温和的可以通过透析去除的非离子型去污试剂，该提取方法高于传统的反复冻溶法和超声法，已经在培养的COS-7, NIH3T3, Hepa 1-6, 293, CHO 细胞中得到验证，提取的蛋白质可以限度的保持活性，可以用于1D，2D电泳，免疫共沉淀，Pull Down,EMSA，报告基因分析(Luciferase, β-galactosidase, Acetyltransferase等), 蛋白质激酶分析 (PKA, PKC, Tyrosine Kinase等), 酶免分析 (Western blot, ELISA, RIA) 等。由抽提试剂，蛋白酶，DTT和PMSF组成，本试剂盒可以使用20次

产品特点

1． 可以直接裂解贴壁培养的细胞或经过洗涤和收集的刮下的和悬浮培养的细胞。

2． 对于贴壁培养的细胞，蛋白提取效率与反复冻溶法相同；对于刮下的和悬浮培养的细胞，蛋白提取效率高于反复冻溶法和超声破碎法，整个实验过程只需要20分钟左右。

3． 提取的蛋白质可以透析去除离子和去污试剂，或将缓冲液替换为所需要的目的蛋白质的合适缓冲液。

4． 提取的活性蛋白质保持非变性状态，可以直接用于1D，2D电泳，免疫共沉淀，Pull down,EMSA，蛋白纯化，酶活分析等实验。

5． 可以维持报告基因酶(Luciferase, β-galactosidase, Acetyltransferase原癌基因(proto-oncogene)，这是指正常细胞基因组中，一旦发生突变或被异常激活后可使细胞发生恶性转化的基因。换言之，在每一个正常细胞基因组里都带有原癌基因，但它不出现致癌活性，只是在发生突变或被异常激活后才变成具有致癌能力的癌基因。癌基因有时又被称为转化基因(transforming gene)，因为已活化的癌基因或是从肿瘤细胞里分离出来的癌基因，可将已建株的NIH3T3小鼠成纤维细胞或其他体外培养的哺乳类细胞，转化成为具有癌变特征的肿瘤细胞。癌基因的形成是反映一种功能的获得(gain of function)，即细胞的原癌基因被不适当地激活后，会造成蛋白质产物的结构改变，原癌基因出现组成型激活，以及过量表达或不能在适当的时刻关闭基因的表达等。目前已识别的原癌基因有100多个。等)，蛋白质激酶(PKA, PKC, Tyrosine Kinase等) 的活性。

以6孔板的一个孔为例，先把培养液吸出，加入200ul的细胞裂解液，摇床摇15分钟，加loading

buffer冰上放置5分钟，用细胞刮把皿底刮几次，然后全部吸出放到离心管里，95°水浴或者金属浴煮10分钟。

疱疹科的基因组及其功能

rige无血清培养基中,充分混均。取上述稀释的Matrigell

疱疹的基因组比多瘤和腺大且复杂，因此基因组的研究进展相对较 慢. 近些年来，由于新技术的应用，疱疹的分子生物学，特别是HSV 基因组研究 还是获得了不少进展. 应用限制性内切酶的性DNA 的转染试验，证明疱疹的基因组内具有转化活性的区域，如在HSV- Ⅰ型基因组发现一段为Xba Ⅰ切下的 23kb 的F 段，可使仓鼠胚胎细胞发生灶性的转化，转化的细胞可在半固体培养其中生长. 这种基因组的片段称为形态转化区域Ⅰ（mtr Ⅰ） ，可编码一种糖蛋白，能与 DNA 结合. 但是被HSV-DNA 片段转化的细胞中没有检测到性DNA.HSH- Ⅱ型 SNA 中也发现有mtr Ⅱ（7.5kb) 和mtr Ⅲ（22kb) 两个片段，mtr Ⅱ在体外能转化仓鼠、大鼠 胚胎细胞和BALB/3T3 、NIH/3T3 细胞;mtr Ⅲ片段能转化仓鼠胎细胞.mtr Ⅲ片段功能上 分为两个亚片段，在细胞转化中相继地起作用，即细胞生的永生化和转变为瘤性细 胞. 但是HSV- Ⅱ的mtr Ⅱ和mtr Ⅲ片段与HSV- Ⅰ型的mtr Ⅰ没有同源性，因此， 这两型对细胞的转化是通过不同的机理实现的. 另外，有兴趣的是，HSV- Ⅱ型的 转化区域都不编码任何早期的产物，这也是与SV40 、PY 和腺转化机理的不 同之处.

人类脐静脉内皮细胞迁移能力的抑制作用没有将多余苏木素洗去,直接脱水、透明,造成细胞背景模糊,细胞不清楚(见图1)

有哪位高手能详细指导一下用transwell板做细胞趋化实验的具体方法和步骤吗？

-20

细胞迁移实验步骤（neuroprobe的使用方法）

凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞。小心取出上室,用线拴住,并做好标记,用冰预冷的甲醇固定30

1．膜预处理

苏木素染液，梯度乙醇，溶液。

h2o

+1.5ml

醋酸+150μl

鼠尾胶原置于50ml的离心管。在膜的粗糙面用铅笔做标记，放入上述溶液中4度过夜。

实验前将膜取出，放入装有pbs的培养皿中漂洗一遍，再用饥饿培养基洗一遍，吸去培养基后加入新的饥饿培养基，放入37度培养箱中。

2.

处理细胞

将细胞消化，调浓度1×105个/ml，细胞迁移装置下层加入166μl含有因子的饥饿培养基。小心铺好膜（粗面朝下），装好塑料垫，固定上层装置。上层加入100μl细胞悬液，迁移4-6h。

3.

固定

小心将膜取下来，在用pbs弄湿的滤纸上挂掉光滑面的细胞，在新的滤纸上粗面朝上放置，晾干。然后再甲醇里粗面朝上固定5min，晾干。

染色

粗面朝下置于结晶紫染液中30min，取出膜用双蒸水漂洗一遍，粗面朝上放在载玻片上，数细胞。

这个方法比transwell方便。与boyden

chemper法类似。

1材料与方法

1.

1Matrigel：Becton

Dickinson

Compary,

℃保存；

Tanswell

plate：Costar

,USA

,#

3422

,聚碳酯膜微孔直径为8μm；

1.

2趋化因子的制备

取传代第二天长势良好的NIH3T3细胞,无血清培养基轻柔漂洗两次;

加入无血清培养基,37℃,5

%CO2

培养24

h～48h，收集细胞培养上清；4

℃,12

000rpm

离心,10

min

,取上清；0.22

μm

滤膜过滤除菌；分装,在-

20

℃保存。

1.

3transwell

所有作均需无菌作。-20℃保存的Matrigel

在冰上保2℃～8℃过夜融化。在冰上用预冷的枪头吸取100μl

Matrigel

加入冰预冷的300μl

25

μl

加入transwell

板上室,覆盖整个聚碳酯膜,37

℃,30

min

,使Matrigel

培养板置于37℃可保存2

周。

1.

4Matrigel

侵袭实验(Matrigel

Invasion

Assay)后的各组细胞用PBS

漂洗3

次。以常规方法用无血清培养基制备单细胞悬液,5

ml

,每组细胞各分为两部分。胎盘兰拒染实验,细胞活力需大于95

%。Transwell

培养板上室加入100μl

细胞悬液(

5×104

个)

并加入无血清培养基200

ul

。Transwell

培养板下室加入500μl

趋化因子,37℃,5

%CO2

培养24

h。用湿棉签轻轻擦去Matrigel

min。苏木素染色1

min。梯度乙醇脱水(80

%,95

%,100

%)

,透明。小心将聚碳酯膜自上室基底切取下来,置载玻片上中性树脂封片。附着于聚碳酯膜下表面的细胞在高倍镜下(

×400)

随机取6

个视野[1

]计数,取平均数。重复实验两次。

注意

2.

1NIH3T3

细胞制备的趋化因子与胎牛血清

趋化因子是能使细胞产生趋化运动的一类细胞因子[2

]。目前利用NIH3T3

细胞制备趋化因子做细胞体外侵袭实验的实验室比较多,时间较长且实验步骤繁琐。众所周知,胎牛血清中有趋化因子,我们在不同浓度TNFα下的HCCC29810

胆囊癌细胞体外侵袭能力的强弱实验中发现用胎牛血清和用NIH3T3

细胞制备的趋化因子做细胞体外侵袭实验效果是一样的,两组迁移的细胞数很接近。在实验时间上，用NIH3

T3细胞制备趋化因子做细胞体外侵袭实验周期为1

周,而用胎牛血清作趋化因子做细胞体外侵袭实验周期为2

d,实验时间节省了很多。因此认为可以用胎牛血清来代替NIH3T3

细胞制备的趋化因子。

2.

2细胞的准备

所需细胞应处在对数生长期,细胞活力需大于95

%。如果细胞活力小,就会造成细胞穿透能力下降,影响实验结果。

2.

3擦去Matrigel

凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞

先用干棉签将上室内液体吸去,再用蒸馏水浸湿的棉签轻轻擦去Mat

凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞,如果没有擦净聚碳酯膜上表面的细胞,在细胞计数时就会将没擦掉的细胞也计进来。尤其是细胞为圆形的时候,就会分辨不出是穿过去的细胞还是没穿过去的细胞,对于长梭形细胞来说,穿过去的细胞为长梭形,没穿过去的细胞多为圆形。

2.

4苏木素染色

上室浸泡在新苏木素中的时间为1

min

,用过多次的苏木素为2

min。在研究粉防己碱对HUVEC

胆囊癌细胞体外侵袭能力的强弱实验时我们将其置于盛有自来水的烧杯中,反复漂洗几次,将多余苏木素洗去再行脱水、透明;这样做出的细胞背景干净,细胞清楚(见图2)

。

细胞株和细胞系是如何定义的？

细胞系是癌变的细胞 细胞核型发生了改变 细胞膜上的糖蛋白减少 60代以后的细胞

细胞株是指同一界门纲目科属种内，形态，性状稍有别的不同细胞，细胞系是指从一个细胞不断繁殖形成的所有的后代细胞的总称，相当于家谱里面的一个族

细胞株是正常细胞 约60代以内

1—10代为原代培养，细胞的遗传物质没有发生改变，度过次危机以后培养到40-×105个细胞/50代是为细胞株，遗传物质也没有发生变化，这时再向继续培养就难了，50代以后度过第二次危机的细胞就可以无限分裂，这时遗传物质发生改变，被称为细胞系，也就是癌细胞。